15.29.
XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG THIMEROSAL TRONG VẮC XIN VÀ SINH
PHẨM
Có 3 phương pháp để
xác định hàm lượng thimerosal
trong vắc xin và sinh phẩm. Tùy theo khả năng
hiện có về thiết bị và hóa chất tại cơ
sở để chọn 1 trong 3 phương pháp thử
nghiệm sau đây: phương pháp đo quang phổ, hóa
học và phương pháp vi sinh vật.
Phương pháp hóa lý
Nguyên lý
Dựa vào phản ứng
giải phóng ion thủy ngân tự do từ thimerosal, kết hợp với dithizon thành dithizon-thủy ngân, xác định
bằng cách so màu.
Cách
tiến hành
Làm song song 2 mẫu (mẫu vắc
xin thử và mẫu chứng nước cất), lấy
0,2 ml mỗi mẫu cho vào từng bình nút mài riêng biệt có
dung tích 100 ml.
Cho vào mỗi bình 1,2 ml acid
sulfuric đậm đặc (TT), pha loãng 2 lần tính
theo thể tích và đun nhẹ bình số 1 (chứa mẫu
vắc xin thử) trong cách thủy cho đến khi tan
hết. Thêm vào mối bình 5 ml dung
dịch kali permanganat 5% (TT),
lắc đều và để yên trong 1 giờ.
Loại bỏ kali permanganat
thừa bằng cách thêm 1,5 ml dung
dịch hydroxylamin clorid 10%
(TT), thêm 35ml nước cất 2 lần, 5 ml dung dịch acid acetic
6 M (TT) và trộn
đều. Dùng buret thêm chính xác vào mỗi bình 10 ml dung dịch dithizon 0,001% và lắc 30 giây.
Chuyển toàn bộ dung
dịch thử của từng bình vào mỗi bình lắng
gạn riêng biệt, tách lớp cloroform
qua một lớp bông đã hấp và sấy khô vào các
ống nghiệm. Đo mật độ quang ( Phụ lục
4.1) ở bước sóng 580 ± 10 nm (kính lọc màu da cam)
hoặc bước sóng 597 ± 10 nm (kính lọc màu đỏ).
Hàm lượng thimerosal (μg/ml) có trong vacxin
thử được tính theo công thức:
a x 100
X= = a x 10,1
0,2 x 49,55
Trong đó: a : lượng thủy ngân
(μg) xác định được theo đường
chuẩn.
0,2 :
số ml dung dịch vắc xin thử
49,55 :
hàm lượng thủy ngân có trong 100 phần của thimerosal
Cách
dựng đường chuẩn
Cân chính xác 0,5 g thủy ngân, hòa
vào 15 ml acid nitric đậm đặc (TT) và
thêm nước cất
vừa đủ 500 ml, được dung dịch thủy
ngân có hàm lượng 1 mg/ml (DD*). Xác định hàm
lượng thủy ngân như sau: Lấy 10 ml DD*, cho thêm 10
giọt dung dịch phèn
sắt amoni 10% và chuẩn độ từ
từ với dung dịch amoni sulfocyanid
0,01 N (CĐ) cho
đến khi xuất hiện màu da cam.
1 ml dung
dịch amoni sulfocyanid 0,01 N
(CĐ) tương
đương với 0,001- 0,003 g thủy ngân.
Lấy 5 bình nút mài có dung tích
100 ml để tiến hành song song 5 thí nghiệm với 5
mẫu: 0,4 ml, 0,6 ml, 0,8 ml, 1,0 ml, 1,2 ml dung dịch thủy
ngân chuẩn trên. Thêm vào mỗi bình 1,2 ml acid sulfuric đậm đặc (TT)
đã pha loãng 2 lần và 3 ml nước
cất 2 lần. Nếu không có nước cất 2 lần thì sử dụng
nước xử lý dithizon
như sau: Cho vào mỗi bình gạn 10 ml dung dịch dithizon (TT) (0,01 g ditizon/1 lít nước), sau đó tách
phần cloroform ra. Nếu màu của dithizon thay đổi
thì làm đi làm lại vài lần cho đến khi màu
của dithizon không thay đổi. Thêm 5 ml dung dịch natri clorid
0,9% (TT) và 5 ml dung dịch acid acetic 6 M (TT) và tiến hành tiếp tục
như đối với mẫu kiểm tra ghi ở
phần trên. Các kết quả thu được cho phép
lập một đường chuẩn về thủy ngân.
Cách pha dung dịch dithizon 0,001%
- Cân chính
xác 10 mg dithizon hòa tan vào cloroform (TT) và thêm vừa đủ 100 ml với cùng dung môi..
- Bảo
quản dung dịch ở chỗ tối 4 – 8 oC
trong vòng 1 tháng. Trước khi dùng pha loãng 10 lần.
Phương
pháp vi sinh vật
Nguyên lý
Phương pháp thực
hiện dựa trên sự hình thành vòng ức chế kháng
khuẩn được tạo bởi dung dịch thimerosal chuẩn và thimerosal có trong mẫu thử;
so sánh đường kính vòng ức chế kháng khuẩn.
Cách
tiến hành
Pha thạch thường,
đun nóng chảy hoàn toàn và đổ thạch dày 4 mm lên
một phiến kính hình chữ nhật phẳng. Để
thạch nguội hoàn toàn, đục lỗ thạch
(đường kính 8 mm) sao cho khoảng cách giữa các
lỗ thạch ít nhất là 30 mm. Cấy chủng Staphylococcus aureus trên thạch
nghiêng, ủ ở 37 oC/18 - 24 giờ. Gặt và pha
vi khuẩn bằng nước
muối sinh lý vô khuẩn thành huyền dịch 109
vi khuẩn/ml. Láng đều huyền dịch vi khuẩn
(0,5 ml/đĩa thạch) trên đĩa thạch đã
đục lỗ. Nhỏ vào mỗi lỗ 100 ml dung dịch thimerosal chuẩn chứa 1 g thimerosal/1lít
ở các độ pha loãng 1/2,5, 1/5, 1/10, 1/20, 1/40, 1/80, 1/160.
Ủ ở 37 oC/24 giờ.
Đọc
kết quả
Đo đường kính các
vùng ức chế vi khuẩn mọc của các đậm
độ thimerosal chuẩn,
xây dựng đường chuẩn. Dựa vào
đường chuẩn và đường kính vùng ức
chế của vắc xin mẫu thử để tính ra hàm
lượng thimerosal có trong
vắc xin mẫu thử.
Tiêu
chẩu chấp thuận
Hàm lượng thimerosal trong mỗi vacxin và
sinh phẩm có thể khác nhau tùy theo yêu cầu cụ
thể, nhưng không được thấp hơn hàm lượng
cho thấy có khả năng kháng khuẩn và không cao hơn
115% hàm lượng thimerosal ghi trên nhãn.Yêu cầu chung cho
hàm lượng thimerosal trong
các vắc xin và sinh phẩm có sử dụng thimerosal làm chất bảo
quản đều không được vượt
quá 0,02 g%.